1、前言

細(xì)胞毒性評(píng)估材料浸提液中潛在的生物活性物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（）毒性反應(yīng)。

其原理為黃色水溶液MTT在活細(xì)胞內(nèi)代謝性還原，生成不可溶的甲臜。活細(xì)胞的數(shù)目與甲臜溶于醇類(lèi)后用光度計(jì)測(cè)定的色度相關(guān)。

2、試驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

2.1 GB/T 16886.5 -2022 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)；

2.2 ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices—Part 6: Tests for in vitro cytotoxicity。

3、試驗(yàn)系統(tǒng)

L929細(xì)胞。

4、試驗(yàn)樣品制備

依據(jù)GB/T 16886.12制備浸提液。

5、試驗(yàn)步驟

5.1 細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備

采用酶促消化（胰蛋白酶/EDTA）將培養(yǎng)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中移出，細(xì)胞懸液在200g離心3min。用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×105個(gè)細(xì)胞/Ml，采用多通道移液器將100μL培養(yǎng)基加到96孔組織培養(yǎng)微量滴定板的外圍孔中（=1×104個(gè)細(xì)胞/孔）。

細(xì)胞孵育24h以形成半?yún)R合單層。培養(yǎng)物在含5±1%的CO2培養(yǎng)箱中(37℃±1℃，濕度>90%)培養(yǎng)（24±2）h，使細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層近融合的細(xì)胞層。

5.2 接觸培養(yǎng)

培養(yǎng)24h后，從板孔中吸出培養(yǎng)液，另加入100μL的測(cè)試樣品浸提液、對(duì)照樣品浸提液、空白對(duì)照液和陽(yáng)性對(duì)照液，所有劑量需要做至少六個(gè)平行。將空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）兩側(cè)。然后在(37±1)℃，含有5±1%的CO2，濕度>90%的環(huán)境下培養(yǎng)24h±2h。

5.3 觀察

繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在相差顯微鏡下檢查每個(gè)板，判定細(xì)胞接種系統(tǒng)誤差和對(duì)照與試驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。記錄試驗(yàn)樣品浸提液細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的改變，但這些記錄不用與任何細(xì)胞毒性定量測(cè)定。對(duì)照細(xì)胞的不良生長(zhǎng)特性可表明實(shí)驗(yàn)誤差，并且可能會(huì)因此放棄該試驗(yàn)。

5.4 添加MTT

檢查平板板孔細(xì)胞生長(zhǎng)情況后，小心地從板孔中吸除培養(yǎng)介質(zhì)，在每個(gè)測(cè)試板孔中加入50μL的MTT溶液（用不含酚紅的完全MEM培養(yǎng)液配置成1mg/mL），在(37±1)℃條件下培養(yǎng)(2±0.2)h。棄去MTT溶液，每孔加入100μL異丙醇溶解甲臜，震蕩平板，然后在570nm波長(zhǎng)下測(cè)量每孔的吸光度值（參照波長(zhǎng)650nm）。

5.4 數(shù)據(jù)分析

活細(xì)胞數(shù)減少導(dǎo)致了樣品中代謝活性降低，這直接與生成的藍(lán)紫色甲臜量有關(guān)。測(cè)試樣品與空白對(duì)照（細(xì)胞直接與浸提介質(zhì)接觸）比較細(xì)胞存活率的降低可用以下公式計(jì)算：

式中：OD570e---測(cè)試樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各組測(cè)得平均吸光度值。

OD570b---空白對(duì)照組（細(xì)胞直接與浸提介質(zhì)接觸）平均吸光度值。

存活率較低時(shí)，試驗(yàn)樣品潛在的細(xì)胞毒性較高。如存活率下降＜空白的70%，則魚(yú)油潛在的細(xì)胞毒性。試驗(yàn)樣品50%浸提液的存活率相同或較高，否則宜重復(fù)試驗(yàn)。